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荧光免疫测定技术的概念
点击次数:260 发布时间:2019-07-16

1 、荧光免疫测定技术的概念:将试剂抗原或试剂抗体用荧光素进行标记,试剂与标本中相应的抗体或抗原反应后,测定复合物中的荧光素,这种免疫技术,称为免疫荧光素技术。

2、荧光的产生:

  物质吸收外界能量而进入激发状态,在回复基态时多余的能量以电磁辐射的形式释放,即发光,这种光称为荧光。这种物质,称为荧光素。         

  由光激发所引起的荧光,为光致荧光

                            ------荧光免疫技术       

  由化学反应所引起的荧光,为化学荧光

                            ------化学发光技术

3、荧光素的荧光特性:

⑴ 停止供能,荧光现象随即终止

⑵ 对光的吸收和荧光的发射具高度选择性,绿色荧光选蓝色为激发光红色荧光选绿色为激发光

      入射光波长<发射光波长

⑶ 荧光效率:           发射荧光的光量子数

          荧光效率=----------------------------

                            吸收光的光量子数

⑷ 荧光猝灭现象:荧光素的辐射能力减弱

常见荧光素的特性:

  ⑴ FITC:黄色结晶粉末,吸收光(蓝色激发光):490~495nm,

          发射光:520~530nm,明亮的黄绿色荧光

4、荧光亮度的判断标准:一般为四级,即“—”无或可见微弱自发荧光。“+”仅能见明确可见的荧光。“++”可见有明亮的荧光。“+++”可见耀眼的荧光。待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上,而各种对照显示为(±)或(-),即可判定为阳性。

 

5、普通荧光显微镜的操作指南

(1)关闭房间内的电灯,开启显微镜汞灯。为延长汞灯的使用寿命,汞灯开启不到15-30分钟的请在15-30分钟后关闭汞灯。再次打开汞灯电源的间隔时间也应该在15-30分钟以上,避免反复开关。

(2)根据样品荧光素选择相应荧光组件。使用减光片对荧光强度适当调整(因为荧光强度不可调,所以只能使用各种减光片来调整观察效果)

(3)选择滤光片。常用的有绿、蓝、紫、紫外等,分别对应不同的激发光波长。

(4)放好染色切片,找到合适的视野。在荧光状态下观察标本,标本内的荧光会较快的衰减,所以要避免长时间的在荧光下观察,可以先在明场下调整好要观察的位置再使用荧光。

(5)需拍照先确认照相机已装好。

(6)使用结束关闭所有电源并做好使用记录。

(7)如需详细说明,请借阅说明书。

 

 

操作流程(SABC- FITC)三步发光法

细胞爬片

盖玻片的处理:先用洗洁精冲洗干净(用最大号的培养皿,将玻片平铺在上面,把洗洁精弄出泡泡,放在水平摇床上摇30min~60min)→用自来水冲洗干净(先放在水上冲,再加上自来水在摇床上摇约30min×3次)→将浓硫酸加入培养皿中,泡酸24 h→自来水冲洗干净→ddH2O冲洗30~50min×3次→放入60℃烤箱烤干→用纱布将玻片平摊开来,隔层包裹→置于饭盒中高温高压消毒

细胞长满,0.25%胰酶消化,细胞计数,接种至6孔板,每孔约3ml细胞悬液,加完后在边上轻轻吹几下,十字形晃动数次,保证细胞在盖玻片上均匀覆盖。(注意:1、预实验时,摸一个的细胞量,一般3~5×105为宜;2、先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基,目的是使玻片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起,然后放玻片,防止加细胞悬液时玻片漂起,造成双层细胞贴片。3、整个过程注意无菌操作。)

培养24h,待细胞接近60%~70%汇合

取出六孔板,浸入0.01MPBS,约3ml/孔,于摇床上摇5min×3次

固定:

4%多聚甲醛固定30min(室温),约2ml/孔

弃干净液体,(用吸管在边缘处轻轻吹打几次)浸入0.01MPBS于摇床上摇5min×3次

破膜:

加0.1%TritonX-100,20min,室温,约2ml/孔

弃干净液体,(用吸管在边缘处轻轻吹打几次)浸入0.01MPBS于摇床上摇5min×3次

消除非特异性反应:

浸入0.75%H2O2,在37℃作用30min(配方:1ml30%H2O2+39ml 0.01M PBS,现用现配,避光保存)

弃干净液体,浸入0.01MPBS于摇床上摇5min×3次

以下操作均在湿盒中进行

封闭:

滴加用0.01M PBS1:10稀释的正常血清封闭液,37℃,30min(注意:150ul/孔;吸去多余的液体,不要洗)

免疫反应:

滴加0.01M PBS按一定比例稀释的一抗,150ul/孔(稀释度,一般取推荐浓度的中间值),37℃,30min后,4℃过夜

复温,室温放置30~45min,(用or不用37℃放置10~20 min)【一抗孵育,总时长在16~18h

弃干净液体,浸入0.01MPBS于摇床上摇5min×3次

滴加0.01M PBS 1:100稀释的生物素化二抗,150ul/孔,37℃,30min

弃干净液体,浸入0.01MPBS于摇床上摇5min×3次

发光:(此操作一定要避光,可以将摇床拿入暗室当中,)

滴加0.01M PBS 1:100稀释的SABC-FITC,150ul/孔,37℃,30min

弃干净液体,浸入0.01MPBS,5min×3~4次(一定要洗干净,否则背景会很高)

取玻片时由于玻片与培养皿底结合较紧,张力较大,将注射器针头针尖向背面弄个小钩,这样将爬片轻轻勾起,用小镊子取出就可以了

缓冲甘油封片,荧光显微镜观察

 

注意事项:

1、在六孔板间隙的孔中加入0.01M PBS,制成湿盒环境。

2、需设绝对空白对照。从加一抗开始,绝对空白对照组全部用0.01M PBS。

3、荧光染色后一般在1h内完成观察,或于4℃保存4h,时间过长 ,会使荧光减弱。

4、需在操作的各个步骤中,始终保持湿润,避免干燥。

5、所滴加的待检抗体标本或荧光标记物,应始终保持在已知抗原标本片上,避免因放置不平使液体流失,从而造成非特异性荧光染色。

 

试剂配制:

1、0.01M PBS       1000ml            2000ml         5000ml

   NaCl             8.5g             17.0g          42.5g

   NaH2PO4.2H2O      0.3g               0.6g           1.5g

  Na2HPO4.12H2O      2.9g               5.8g          14.5g

 

2、0.1%TritonX-100

   TritonX-100       100ul   定容至    常温保存备用

   0.01M PBS         100ml   100ml

 

 

3、4%多聚甲醛

   多聚甲醛         4g         60℃约5min+2滴2mol/L    摇晃 ,定容至100ml

   0.01M PBS        100ml         NaOH助溶 PH=7.2       4℃保存,zui好2周用完

 

4、0.75% H2O2

    30% H2O2             1ml                现用现配,

  0.01M PBS        39ml               4℃避光保存


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