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实验新手系列:关于wb实验
点击次数:128 发布时间:2019-08-16

一、实验过程中需要注意的问题

①蛋白样品的提取及蛋白含量的检测

 蛋白样品的提取咱们完全是按照试剂盒说明书来做的,步骤没有什么讲的,但是因为蛋白样品的好坏直接决定了是否能做出来蛋白条带,这就好比盖房子所需要的砖头一样,一定要务必认真。

②仪器准备

 清洗玻璃板:玻璃板的正确拿法应该是拿住玻璃板的左右两侧不要用手拿上下两端,避免手套上面的脏东西顺着水流流到玻璃板上,玻璃板请一定务必清洗干净,不干净的玻璃板上面的残留物可能会影响凝胶之间的化学反应,导致胶出现问题,对后面的结果影响很大。

 玻璃板放置:玻璃板底部对齐,垂直放入夹子中间加紧,高的在后,矮的在前。

3凝胶配置

 根据蛋白分子量的大小选择合适浓度的分离胶,可参考凝胶配置试剂盒中说明书或者参考别人的文献。配胶的APS需要在4度冰箱保存。注意配胶的时候胶一定一定要混匀,配胶的试剂中APS与TEMED是促凝剂,所以在加促凝剂之前先把其他组分混匀,可用*吹打也可用手腕去甩,向左甩n次再向右甩n次,或者用咱们实验室的混匀的那个仪器混匀,名字我给忘了,那个效果好产生的气泡很少而且节省人力。。。

④将配置好的分离胶沿着玻璃板一侧缓慢打入玻璃板中,这个时候不用担心打入气泡,灌入合适量的分离胶之后,加入适当剂量的ddWater或者异丙醇封胶(加入封胶试剂量没有规定,盖住整个分离胶胶面即可)

5上样

A. marker孔加入5微升,其余蛋白孔上样10微升左右,不要加的太多,这个后面会做说明。

B. 电泳仪及转膜仪请务必确定正负极是否对准确,不要犯低级错误。

⑥电泳

 这个没有具体的时间限制,只要分子量最小的蛋白跑到胶的底部即可。在电泳过程中是否需要进行压胶还是直接恒压跑到底这个问题后面说明。电泳开始的时候开制冰机制冰,为后面的转膜做准备。

⑦转膜

A. 电泳快结束的时候就可以配置转膜液(转膜液室温20-30度不宜放过长时间,几天内用可以室温放置,如果时间太长可放入4度冰箱保存)

B. 根据自己的蛋白位置选择合适的位置切胶,切胶过程中保持胶的湿润(用蒸馏水不定时润湿),因为胶一旦干了脆性增强,很容易断。

C. 根据胶的大小选择合适大小的膜,膜和胶相同大小或者略小于胶,并且胶面和膜之间不能有气泡,大多数人认为如果膜大于胶会使得转膜过程中胶面短路,一是使得局部的蛋白不能转到膜上去,二是短路会使得局部温度过高(热量=U2/R*t)凝胶受热变形,转到膜上的蛋白歪七扭八,但是丁香园里面有大神说过气泡对于转膜影响不大,我没试验过。。

D. 胶,膜,滤纸,海绵放置成三明治结构,一旦放好不要乱动,否则对齐的胶和膜之间位置会有偏移。

A. 选择合适的转膜时间进行转膜,至于转膜是选择横流还是恒压后面详细赘述,整个转膜过程,转膜仪需放置在冰水混合物中进行。

⑧抗原抗体反应

A. 丽春红染色??(是否需要丽春红染色以及什么情况下需要丽春红染色后面介绍)

B. 剪膜:根据自己的蛋白位置进行剪切

C. 洗膜  5min/3次

D. 封闭  选择适当的封闭液进行封闭(脱脂奶粉或者牛血清白蛋白)封闭多长时间?这个后面介绍

E. 一抗过夜孵育F. 洗膜  5min/3次

G. 二抗孵育 室温一小时

H. 洗膜  5-10min/3次

⑨ECL发光成像

   ECL发光液A液与B液1:1混合,将发光液滴到膜上曝光观察,若是对同一张膜进行其他蛋白曝光处理,可用一抗二抗洗脱液洗脱后重新一抗二抗孵育处理,若是对同一蛋白进行重新曝光则不需要。

 


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